Anti Cas9

図1 ウェスタンブロット
HEK293 細胞に pMLM3613myc を一過的にトランスフェクトし、トランスフェクション40時間後に加温した Laemmli バッファーに溶解した。タンパク質を 7.5% SDS-PAGE で分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーした。ニトロセルロース膜を 3% ドライミルク（NFDM）in PBS-Tween で室温・1時間ブロッキングし、0.5% NFDM in PBS-T で希釈した各抗体で室温・2時間インキュベートした。その後、HRP 標識抗マウス抗体 および 抗 BLUE protein marker 抗体と室温・1時間インキュベートした。タンパク質を ECL により可視化した。

図2 免疫蛍光分析
Hela 細胞に、N末端に Flag タグを付加した S. pyogenes 由来 Cas9 発現ベクターを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション48時間後に、細胞を 3.7% ホルムアルデヒドで固定、0.5% Triton-X で透過処理した後、2% BSA in PBS で室温・2時間ブロッキングした。各抗体を用いて細胞を4℃・O/N染色し、抗マウス AF488 抗体と室温・1時間、その後二次抗体とインキュベートした。核は Hoechst 33342 で対比染色した。画像は Axiovert 135 TV 蛍光顕微鏡で撮影した（プレゼンテーション用に明るさとコントラストを調整）。

図3 免疫沈降
N末端に Flag タグを付加した S. pyogenes 由来 Cas9 を発現する HEK293T 細胞を、トランスフェクション72時間後に Hunt バッファーに再懸濁し、3回の凍結融解（液体窒素中／氷上）を行うことで溶解した。全細胞ライセート 100 μg を用いて、以下の条件でタンパク質を免疫沈降した。クルードな Cas9（クローン 7A9）細胞培養上清（レーン3： IgG 濃度未測定）と4℃・1時間インキュベートし、その後 protein A/G セファロースビーズを 1:1 で混合したものと4℃・1時間インキュベートした。または、protein A/G セファロースビーズ（1:1）と架橋した Cas9 クローン 7A9 モノクローナル抗体と4℃・2時間インキュベートした。ビーズを Hunt バッファーで2回、TBSで1回洗浄した。Laemmli バッファー中で煮沸して結合したタンパク質を溶出し、7.5% SDS-PAGE で分離した後、ニトロセルロース膜にトランスファーした。ニトロセルロース膜を 3% dry milk (NFDM) in PBS-Tween で室温・1時間ブロッキングし、0.5% NFDM in PBS-T で希釈した Cas9 7A9 モノクロ

ーナル抗体で室温・1時間、その後HRP標識した抗マウス抗体でインキュベートした。タンパク質を ECL により可視化した。アスタリスク（*）は IgG 重鎖を示す。